Er zijn verschillende ALS-genen bekend. Een verandering (mutatie) in deze genen veroorzaakt de familiaire vorm van ALS. Een aantal van deze gen veranderingen zijn ook gevonden bij patiënten bij wie ALS niet in de familie voorkomt. Het is grotendeels onbekend wat de ALS-genen doen in de motorische zenuwcellen en waarom motorische zenuwcellen afsterven als er een mutatie in zo’n gen is. Onderzoekers van het ALS Centrum in het UMC Utrecht kweken stamcellen uit de huidcellen van ALS-patiënten. Deze stamcellen laten zij in het laboratorium uitgroeien tot motorische zenuwcellen. Dit stelt de onderzoekers in staat na te gaan wat er mis gaat in de motorische zenuwcel. En op die zenuwcellen proberen de onderzoekers vervolgens nieuwe behandelingen uit. De zenuwcellen die uit stamcellen zijn ontwikkeld bieden dus een model om mogelijke nieuwe therapieën te testen.
In de afgelopen periode hebben we in het lab met behulp van de iPSC-techniek (waarbij we van menselijke huidcellen andere cellen kunnen kweken) stamcellijnen gemaakt die de ALS-mutaties NEK1 en C21orf2 hebben. Uit deze stamcellijnen hebben we motorische zenuwcellen gekweekt. Vervolgens hebben we gekeken naar het verschil tussen gezonde motorische zenuwcellen en de zenuwcellen die ALS-mutaties hebben. De eerste resultaten laten een verschil zien tussen de gezonde cellen en die met de ALS-mutatie.
Op dit moment zijn we bezig de verschillen verder te analyseren. Ook willen we iPSC-cellijnen met andere ALS-mutaties produceren om zo én betrouwbaardere resultaten én meer inzicht in het ontstaan van de ziekte in het lichaam te krijgen. Ook hebben we onderzoek gedaan naar zes recent ontdekte ALS-eiwitten. We hebben gekeken naar de interacties tussen verschillende eiwitten in de zenuwcel. Door de resultaten van zes verschillende eiwitten te vergelijken, kunnen we de onderliggende mechanismen ontdekken die ALS veroorzaken in de cel zelf. De volgende stap is om onze resultaten te vergelijken met bestaande wetenschappelijke publicaties over andere ALS-eiwitten. Zo proberen we de belangrijkste mechanismen die ALS veroorzaken in het lichaam te achterhalen. Daarnaast doen we in dit project onderzoek naar het effect van ATXN2-mutaties in zenuwcellen.
In de afgelopen periode hebben we DNA expressie-data van muismodellen vergeleken met zenuwcellen van patiënten. In beiden vonden we dezelfde afwijkingen in de mitochondriale ademhaling en metabolisme (beide zijn chemische reacties die energie geven aan een cel). Met deze resultaten gaan we nu kijken of in diermodellen met de ATXN2-mutatie zenuwcellen afsterven, er spierzwakte optreedt en/of er spierontstekingen plaatsvinden.
Tot slot zijn we de afgelopen maanden bezig geweest om via meerdere samenwerkingen met andere laboratoria in de wereld C9orf72 iPSC-cellen te krijgen. Tot nu toe hebben deze samenwerkingen vijf nieuwe, verschillende cellijnen van patiënten met C9orf72 en vergelijkbare gezonde controle cellijnen opgeleverd. Op basis van deze cellijnen hebben we mini-breintjes (organoids) gekweekt waarmee we de rol van microgliacellen (cellen die een belangrijke rol spelen in het afweersysteem van het centraal zenuwstelsel) willen onderzoeken. Met de mini-breintjes kunnen we namelijk de interactie tussen de microgliacellen en zenuwcellen, en hun reactie op ontstekingen bij mensen met C9orf72 en frontemporale dementie (FTD) bestuderen. In de komende maanden gaan we onderzoeken of de mechanismen in deze celreacties anders zijn bij de minibreintjes met C9orf72 en FTD dan bij de controlegroep.
In augustus 2019 zijn we begonnen met het onderzoek naar zes ALS-gerelateerde eiwitten. Met behulp van de ‘massa-spectrometrie’-techniek hebben we ontdekt met welke andere eiwitten deze zes ALS-eiwitten in contact komen. Nu dit is afgerond, gaan we onze resultaten bevestigen met behulp van biochemische experimenten. Ook onderzoeken we of de ALS-eiwitten interacties aangaan met gemeenschappelijke eiwitten. Dit zou namelijk meer inzicht kunnen geven in de oorzaak van het verlies van motorische zenuwcellen in ALS.
In een ander onderdeel van het project proberen we te achterhalen hoe de ATXN2-mutatie bijdraagt aan celdood van motorische zenuwcellen bij ALS. Hiervoor gebruiken we zelfgemaakte muismodellen en zenuwcellen van patiënten met de ATXN2-mutatie. Zo hebben we defecten ontdekt in belangrijke onderdelen van de cel: de mitochondriën, ook wel de energiefabrieken van de cel. Als er iets misgaat in de mitochondriën, krijgen cellen minder energie wat kan leiden tot een verminderde werking en celdood.
Momenteel proberen we in kaart te brengen wat er precies misgaat in de mitochondriën en hoe we dit kunnen voorkomen. Ook hebben we aanwijzingen dat de immuun-cellen van de hersenen (de ‘microglia’) zijn aangedaan door de ATXN2-mutatie. Op dit moment lopen meerdere experimenten om dit te bevestigen en verder te onderzoeken. Om de ziekteprocessen in de zenuwen van ALS patiënten te onderzoeken, is het belangrijk om representatieve ziektemodellen te ontwikkelen. Dit kan bijvoorbeeld door motorische zenuwcellen te kweken vanuit ‘geïnduceerde pluripotente stamcellen’ (iPSC). Met deze techniek worden motorische zenuwcellen gemaakt uit andere menselijke cellen, bijvoorbeeld huidcellen of cellen uit het bloed.
In het afgelopen jaar hebben we al verscheidene iPSC-modellen gemaakt die de ALS-mutaties NEK1 en C21orf2 bevatten. Momenteel maken we nog meer iPSC-modellen die vergelijkbare ALS-mutaties hebben. Ook bestuderen we aan de hand van deze modellen de effecten van de ALS-mutaties op motorische zenuwcellen. Onze eerste resultaten laten al zien dat er verschillen zijn tussen zenuwcellen met en zonder de mutaties. De extra iPSC-modellen die we aan het maken zijn zullen eraan bijdragen dat we op een zeer betrouwbare manier meer te weten kunnen komen over het ziekteproces van ALS.
In de afgelopen periode hebben we de eiwitinteracties van zes verschillende ALS-eiwitten onderzocht. Daarbij hebben we vooral gekeken naar gemeenschappelijke eiwitinteracties tussen de verschillende ALS-eiwitten. Op die manier willen we voor patiënten met verschillende ALS mutaties nieuwe aanknopingspunten vinden voor toekomstige medicijnen.
In eerder onderzoek vonden we dat het ALS-gen C21orf2 (een gen dat in 2016 door onderzoekers van Project MinE is ontdekt) veel bindingen heeft met andere ALS-gerelateerde eiwitten. Dat maakt dit gen interessant om verder te onderzoeken. In de komende periode willen we daarom enkele van de interacties bevestigen en daarnaast ook onderzoeken hoe mutaties van C21orf2 die we bij ALS vinden de eiwitinteracties precies beïnvloeden.
Om het effect van ALS-gerelateerde mutaties in C21orf2 te kunnen onderzoeken gebruiken we ‘geïnduceerde pluripotente stamcellen’ (iPSCs). Eerder hebben we al iPSC-cellen gekweekt die relevante ALS-mutaties van dit gen hadden. De afgelopen periode hebben nog een nieuwe iPSC-cellijn opgezet met dezelfde c21orf2-mutatie. Door het C21orf2-eiwit met verschillende genetische achtergronden te analyseren kunnen we betrouwbaardere resultaten genereren. Onze initiële resultaten laten al verschillen zien tussen zenuwcellen met en zonder ALS-mutaties. In de komende periode gaan we deze resultaten proberen te reproduceren in beide iPSC-cellijnen. Daarnaast gaan we ook andere effecten van ALS-mutaties in het C21orf2-eiwit bestuderen.
In een ander onderdeel van het project proberen we te achterhalen hoe de ATXN2-mutatie bijdraagt aan het ontstaan van ALS. Hiervoor gebruiken we zelfgemaakte muismodellen en zenuwcellen van patiënten met de ATXN2-mutatie. Eerder vonden we al aanwijzingen dat belangrijke onderdelen van de cel: de mitochondriën, ook wel de energiefabrieken van de cel, veranderd zijn in Ataxine-2-muizen. In de afgelopen periode zijn we bezig geweest om deze cellen te isoleren en om met experimenten deze resultaten te kunnen valideren.
Tegelijkertijd zijn we ook bezig om mitochondriën van ALS-patiënten te groeien met behulp van iPSC-technieken. Hiermee kunnen we straks testen of de verschillen in de mitochondriën ook voorkomen bij mensen met ALS. Omdat Ataxine-2 ook een rol speelt bij de stressreactie van cellen, gaan we ook met iPSC-cellen testen hoe zenuwcellen reageren op stress en in hoeverre ze hiervan kunnen herstellen.
In de afgelopen periode hebben we binnen dit project onderzocht hoe motorneuronen van ALS-patiënten met een C21orf2 genafwijking reageren op schade van hun DNA. Daarbij gebruiken we een model met een specifiek chemisch middel om het DNA te breken. Vervolgens kijken we of de mutatie met het C21orf2-gen effect heeft op de capaciteit van de neuronen om de breuk te repareren. De resultaten van dit onderzoek kunnen helpen om mogelijke oorzaken van motorneuron schade bij ALS te vinden.
Verder hebben we, om de precieze impact van ALS-gerelateerde mutaties in het C21orf2 gen op de zenuwcellen te vinden, nu vier iPSC cellijnen gemaakt. Hiervan hebben er twee ALS-mutaties. De andere twee zijn controle cellijnen. De eerste resultaten van onze analyse laten verschillen zien in de zenuwcellen met en zonder genmutatie. We gaan nu onze analyses van het effect van C21orf2 mutaties uitbreiden naar alle iPSC-cellijnen. Daarbij zullen we focusen op het doen en afronden van de analyses en het voorbereiden van een wetenschappelijk artikel waarin we onze bevindingen beschrijven.
In een ander deel van dit project proberen we de precieze rol te achterhalen van ATXN2 bij het ontstaan van ALS en de ernst van de ziekte. Daarbij gebruiken we ALS-muismodellen die specifieke ALS-mutaties in de genen hebben, evenals iPSC-cellen van menselijke zenuwcellen. Uit de eerste resultaten van dit onderzoek blijkt dat de microglia zijn veranderd. Om dat verder te onderzoeken hebben we een protocol opgezet om microglia te isoleren uit ruggenmerg van volwassen muizen. Om meer te weten te komen over het precieze fenotype van microglia gaan we in de komende periode bekijken hoe de microglia reageren op pro-inflammatoire prikkels.
Het doel van TOTALS is om nieuwe modellen op te zetten om de oorzaak van ALS te ontdekken en nieuwe therapieën te ontwikkelen. In de afgelopen periode hebben we gewerkt aan drie grote experimenten. Ten eerste hebben we ‘mini-brientjes’ (hersenorganoids) ontwikkeld uit huidcellen van patienten met C9ORF72 mutaties en gekeken of deze afwijken van hersenorganoids van gezonde mensen met behulp van verschillende geavanceerde technieken (bijvoorbeeld 3D microscopie, single cell RNAseq, EM).
We vinden allerlei afwijkingen op het niveau van de organoid en op dat van individuele cellen (bijvoorbeeld immuuncellen). Op dit moment onderzoeken we welke moleculaire en cellulaire processen tot grondslag liggen aan deze defecten. In een ander project wordt onderzoek gedaan naar repeat expansies in ATXN2, een veel voorkomend genetisch defect bij ALS-patienten.
We hebben stamcel en muismodellen gebruikt om te vinden dat in zenuwcellen met deze mutaties de energiehuishouding is aangedaan maar ook dat er grote afwijkingen zijn in het immuunsysteem. Immuuncellen zien er bijvoorbeeld anders uit en lijken minder goed afval te kunnen opruimen. Tenslotte werken we aan mutaties in C21ORF2 en NEK1 met behulp van stamcelmodellen en biochemische technieken. We zien dat mutaties in deze eiwitten leiden tot defecten in het repareren van DNA-schade, wat weer leidt tot sterfte van motorneuronen en afwijkingen in motorgedrag. Dit laatste hebben we onderzocht in een zebravismodel.
In the last period, we have continued growing mini-brains (organoids) in the lab, whereby we specifically looked at microglia cells and regional identity. Activated microglia are a hallmark of C9ORF72-ALS (CIALS) pathology. To study the contribution of C9ORF72 repeat expansion to an altered immunity and neurodegeneration, we grow organoids that innately develop microglia from ALS patients and healthy individuals. We then isolate the microglia and look into their gene expression with bulk RNAseq. morphology and perform functional assays like phagocytosis. Preliminary results show dysregulation of homeostatic genes, as well as disrupted phagocytosis capacity. Next to that, we are finalizing the analysis of a large gene expression dataset that we created during this organoid project, which allows us to identify relevant brain cell types to further delve into. We already see that some regional markers are lower expressed in ALS patients compared to healthy controls.
Another part of the project focuses on understanding the role of intermediate ATXN2 repeat expansions in the development and disease severity of ALS. For that, we use an ALS mouse model that harbours ALS-associated mutant TDP43 and ATXN2. In the last months, we have concluded that ataxin-2 intermediate repeat expansions impair the assembly of stress granules in primary motor neurons as well as mitochondrial function. Additionally, we have analysed the transcriptome of human microglia derived from iPSC generated from ALS patients carrying ataxin-2 intermediate repeat expansions, which has revealed upregulation of disease-associated genes. Interestingly, these results are concordant with the loss of homeostasis phenotype we observe in microglial cells in our TDP43/ATXN2 mutant mice.
Finally, we have started preparing a manuscript summarizing results focusing on interactions of proteins that have been recently associated with ALS. We have identified metabolic and signaling pathways in neurons connected to these proteins and showed that mutations in the studied proteins can disrupt their interactions. In particular we focused on two proteins C21orf2/CFAP410 and NEK1. Our earlier results clearly show close relationship between these two proteins and we further analyzed the effect that these proteins have on each other. We have previously created iPSC-derived motor neurons carrying mutation in C21orf2/CFAP410 and showed effect of this mutation on neurons and NEK1. We have also created corresponding isogenic iPSC control lines that allow to validate our findings. We aim to finalize the analysis and to complete the manuscript encapsulating our results in the coming months.