Slechts 1 tot 3 procent van het menselijk DNA is belangrijk voor het definiëren van eiwitten (hier zitten onze genen). De overig 97 tot 99% van het DNA is nog grotendeels onontgonnen terrein en werd lang gezien als ‘junk’ of ‘afval’ DNA (niet-coderend DNA). De meeste genetische studies focussen zich daarom op die 1-3% van ons DNA om mutaties te vinden in genen die een ziektebeeld kunnen veroorzaken. Dit was tot recent ook de focus van Project MinE waar het genoom van meer dan 15.000 ALS-patiënten in kaart wordt gebracht om zo het ontstaan van ALS te verklaren.
Een focus op de genen bleek voor de meeste neurologische aandoeningen echter niet voldoende om de genetische basis hiervan te ontrafelen. Dit geldt ook voor ALS, omdat minder dan 20% een ALS mutatie in de genen heeft. Recent werk heeft aangetoond dat de 97-99% niet coderend DNA in ons genoom vol zit met schakelingen (enhancers) die genen aan en uit kunnen zetten en dat deze schakelingen specifiek actief zijn in enkele celtypen (bijvoorbeeld motor neuronen) en niet in andere.
Wij hebben deze schakelingen met behulp van epigenetisch onderzoek op grote schaal in de menselijke hersenen in kaart gebracht en bewijs gevonden dat deze elementen mutaties kunnen bevatten die activiteit van genen kunnen dereguleren om zo een ziektebeeld te veroorzaken. Gezien deze resultaten is het niet onrealistisch dat deze schakelingen mogelijk de ontbrekende genetische informatie bevatten die het ontstaan van ALS kunnen verklaren.
Project MinE is zo opgezet dat ook dit niet coderend DNA in kaart wordt gebracht in relatie tot ALS. Echter om de niet coderende mutaties die bijdragen aan het ontstaan van ALS te kunnen onderscheiden van de natuurlijke DNA variatie tussen individuen, is het uiterst belangrijk dat we er achter komen waar exact deze schakelingen zich bevinden in dit DNA. Omdat deze celtypen specifiek zijn kunnen we schakelingen alleen identificeren in voor ALS relevante celtypen, geïsoleerd uit menselijke hersenen.
Het doel van dit onderzoek is om met behulp van nieuwe technologieën de specifieke eigenschappen van genetische ALS in kaart te brengen die te vinden zijn (in niet-coderend DNA) in ALS relevante celtypes, geïsoleerd uit menselijke hersenen. Door dit onderzoek wordt de whole genome sequencing data van Project MinE optimaal gebruikt en geanalyseerd en kan de genetische basis voor ALS, inclusief de bijdragen van verschillende celtypen in de hersenen, verder worden ontrafeld.
Dit project is een nationale samenwerking tussen laboratoria van het Hubrecht Instituut en het UMC Utrecht waar verschillende onderzoek expertises worden samengebracht om dit epigenetisch onderzoek naar ALS te realiseren. Enkele van onze bevindingen zullen wij valideren door het kweken van humane neuronen afgeleid van huidbiopten van patiënten en gezonde controles om aan te tonen dat niet coderende genetische mutaties in enhancers bijdragen aan het ontstaan van ALS. Hierna kan dit onderzoek op grotere schaal worden uitgerold om verdere targets te valideren.
In maart 2019 is het onderzoek gestart. Eerst is gefocust op het in kaart brengen van de schakelingen in motorneuronen van het menselijke brein. Via het Nederlands Herseninstituut is toegang verkregen tot ruggenmergweefsel van humane donoren. Hieruit hebben we met behulp van markers (NeuN+ en Islet1+) motorneuronen kunnen isoleren. De hoeveelheid neuronen bleek echter laag (<5000), waardoor we onze technieken hebben moeten aanpassen om ook met kleine hoeveelheden cellen te kunnen werken. Dit is gelukt, waardoor we de eerste mijlpaal van het onderzoek die gepland staat voor maart 2020 naar verwachting zullen halen.
Ondanks dat we vanwege het coronavirus wel wat vertraging hebben opgelopen, ligt het project nog op schema.
In de afgelopen periode heeft de PhD-student (Ilia Timparano) die voor dit project is aangetrokken, de benodigde trainingen gevolgd om alle relevante faciliteiten in het UMCU Hersencentrum te mogen gebruiken. Daarnaast is hij gestart met zowel de experimentele onderdelen en computerberekeningen voor dit project.
Verder hebben we succesvol de technische problemen verholpen die we eerder tegenkwamen bij het isoleren van voldoende materiaal bij zuiveren van neuronen die we uit (post-mortem) menselijk ruggenmergweefsel halen. Hierdoor hebben we nu succesvol de eerste data weten te produceren uit een batch met gezuiverde neuronen. Deze gegevens gaan we in de komende periode analyseren om zo nieuwe informatie te verschaffen over neuronen in het ruggenmerg bij mensen met ALS. Daarnaast willen we de data integreren met de DNA-profielen uit project MinE om zo hopelijk nieuwe risicogenen te ontdekken.
Tegelijkertijd hebben we gewerkt aan een nieuwe manier om de zuivering van verschillende soorten menselijke motorneuronen te verbeteren. We hebben ook materiaal geanalyseerd van in het laboratorium gekweekte motorneuronen (iPSC cellen die gekweekt zijn binnen project TOTALS) die door verschillende groepen over de hele wereld worden gebruikt om ALS te bestuderen. We bereiden de gegevens die we hieruit gegenereerd hebben nu voor om te kunnen vergelijken met de gegevens die we hebben gehaald uit de gezuiverd ruggenmergneuronen. Deze vergelijking zal helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over de laboratoriummodellen die gebruikt worden bij medicijnontwikkeling van ALS. Daarnaast kan het ook een referentiekader bieden voor andere analyses die uit post mortem materiaal zijn verkregen.
De belangrijkste doelstelling voor de eerste twee jaar van dit project is om een atlas van DNA-activiteit in relevante ALS cellen te maken. Deze atlas gaan we dan integreren met de hele genoomassociatiestudies van Project MinE. Daarmee kunnen we uiteindelijk bepalen welke celtypes zijn aangedaan door ALS-genmutaties.
Het maken van deze atlas is een uitdaging, omdat bepaalde celtypen enorm moeilijk te isoleren zijn. Om dit op te lossen hebben we meerdere aanpakken in gang gezet:
De huidige profielen bieden nog geen compleet beeld van de DNA activiteit in grote celtypes, maar we menen dat aanvullende analyses met ‘single cell’ technologieën belangrijke gaten in de data kunnen vullen.
Ondanks dat we nog geen compleet beeld hebben, hebben vorige datasets al belangrijke kandidaat-signalen opgeleverd waar verder ingedoken kan worden. We gaan genetische analyses nu zo updaten dat ze belangrijke signalen prioriteren voor aanvullende onderzoek de laatste fase van dit project.
The project has now conducted genetic analyses that integrate ALS patient DNA sequencing (from project MinE) with 3 separate single cell atlases of the human brain. One of these cell atlases specifically describes DNA activity patterns within cells of the adult motor cortex, a priority brain region for ALS research. The two remaining cell atlases describe DNA activity patterns across broader brain regions.
The use of 3 cell atlases provided the project with a means to 1) assess the reproducibility of novel genetic signals across independent brain datasets 2) assess the specificity of novel genetic signals for the motor cortex and 3) assess whether novel genetic signals exclusively impact the adult brain or may also impact early developmental stages.
Analysis of all 3 cell atlases yielded consistent results and indicated candidate modulatory events for further study. Additional statistical analyses revealed no evidence that genetic analyses may have been biased by biological / technical confounders (e.g. variation in sample quality or individual genetic characteristics) or other potential sources of data modelling error. Secondary analyses of the cell atlas datasets allowed the project to relate candidate modulatory events to predicted biological effects in specific brain cell types.
Additional work to validate and further characterise all results from this phase of the project are ongoing. This includes assessment of ALS patient autopsy material, computational modelling of DNA mutations detected by project MinE and testing experimental readouts in laboratory models. Thus far, the laboratory experiments have involved using CRISPR genome editing to manipulate DNA regions of interest in neuron like cells. Preparations have been made to extend these investigations to more advanced ALS stem cell models as needed.